疫情之后，PCR技術(shù)成為了極度普及的基礎(chǔ)技術(shù)，各種產(chǎn)品如雨后春筍出現(xiàn)，其中熒光定量PCR競(jìng)爭(zhēng)白熱化，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)已達(dá)平臺(tái)期。

在選擇新的技術(shù)方向時(shí)，數(shù)字PCR或許也是一種不錯(cuò)的選擇。讓我們一起學(xué)習(xí)下...

1.數(shù)字PCR的概念

1988年，Kary Mullis驗(yàn)證了基因在稀釋到極低的豐度（達(dá)到單分子水平）后，經(jīng)過(guò)40個(gè)熱循環(huán)步驟依舊可以擴(kuò)增到能夠檢測(cè)到的量。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了單分子模板可以擴(kuò)增的事實(shí)，為數(shù)字PCR單分子檢測(cè)技術(shù)打下了基礎(chǔ)。1992年，Sykes等人提出了一種基于有限稀釋的核酸定量方法，該方法提出了一個(gè)重要的原則：以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)（all-or none end point）”作為反應(yīng)單元陰陽(yáng)性的判斷標(biāo)志，該方法是數(shù)字PCR技術(shù)的理論基礎(chǔ)。1999年，Kinzler和Vogelstein等明確提出了數(shù)字PCR的概念，他們通過(guò)有限稀釋的策略，對(duì)致癌基因KRAS突變型進(jìn)行了定量分析。如圖1-1所示，首先，DNA樣本被稀釋到很低的濃度，約0.5個(gè)拷貝每孔，然后把樣本分散到獨(dú)立的反應(yīng)單元內(nèi)，并在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后，加入熒光探針，對(duì)每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)孔內(nèi)的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度判斷每一個(gè)獨(dú)立反應(yīng)單元內(nèi)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在野生型和突變型DNA序列；最后根據(jù)相應(yīng)比例的突變和野生DNA數(shù)目，進(jìn)行突變頻率的判定。該實(shí)驗(yàn)限于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的局限性，樣本分割的過(guò)程是在384孔板中進(jìn)行的。其操作過(guò)程的復(fù)雜性，限制了數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展，導(dǎo)致數(shù)字PCR在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，發(fā)展相對(duì)緩慢。

圖1數(shù)字PCR技術(shù)原理。

2. 基于泊松分布的核酸定量原理

圖2是數(shù)字PCR的檢測(cè)流程，數(shù)字PCR最核心的技術(shù)策略在于把模板分子隨機(jī)的分配到數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元中，理想狀態(tài)下使每個(gè)反應(yīng)單元中包含1個(gè)或者不包含模板分子，被分割的模板分子在獨(dú)立的反應(yīng)單元內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在擴(kuò)增終點(diǎn)，通過(guò)熒光染料或探針技術(shù)檢測(cè)每一個(gè)獨(dú)立反應(yīng)單元中的熒光信號(hào)，根據(jù)信號(hào)差異，可以直接計(jì)數(shù)出出含有模板分子的反應(yīng)單元個(gè)數(shù)，進(jìn)而直接實(shí)現(xiàn)反應(yīng)液中模板分子濃度的定量。然而，在實(shí)際操作中，模板分子在隨機(jī)分散時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)甚至多個(gè)模板分子進(jìn)入到同一個(gè)反應(yīng)單元內(nèi)的情況發(fā)生，而在擴(kuò)增終點(diǎn)，含有模板分子的反應(yīng)單元具有相同的熒光強(qiáng)度，難以區(qū)分多個(gè)模板和一個(gè)模板的反應(yīng)單元。所以，簡(jiǎn)單的通過(guò)陽(yáng)性分區(qū)的個(gè)數(shù)來(lái)直接統(tǒng)計(jì)模板分子個(gè)數(shù)的方式會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，尤其是在模板濃度較高的情況下。為了解決這個(gè)問(wèn)題，多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法被用來(lái)進(jìn)行數(shù)字PCR的模板分子定量。其中，最常用的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是泊松分布。

圖 2 數(shù)字PCR檢測(cè)流程。

基于泊松分布的數(shù)字PCR定量原理可以簡(jiǎn)單描述如下：假設(shè)模板分子在溶液中是均勻分散的，個(gè)分子隨機(jī)分布到個(gè)反應(yīng)單元中，這種情況對(duì)應(yīng)于一個(gè)二項(xiàng)式過(guò)程，即每個(gè)過(guò)程的結(jié)果要么出現(xiàn)要么不出現(xiàn)，并且重復(fù)次。目標(biāo)分子出現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)單元中的概率是，因?yàn)樗请S機(jī)事件或獨(dú)立事件的結(jié)果。一個(gè)反應(yīng)單元有次機(jī)會(huì)分配到一個(gè)目標(biāo)分子。一個(gè)反應(yīng)單元在一次分配之后為空的概率是，在次嘗試之后是，最后為空的反應(yīng)單元的概率。在很大(很小)的情況下，()可以看作是的一階近似。因此，概率可以近似為，這里λ為反應(yīng)單元中所含有的平均分子拷貝數(shù)，為陰性反應(yīng)單元數(shù)目。因此，已知陽(yáng)性反應(yīng)單元個(gè)數(shù)，即可實(shí)現(xiàn)原始樣本中模板分子的定量，平均分子拷貝數(shù)，這個(gè)公式定義了數(shù)字PCR泊松分布的概率函數(shù)。

3. 數(shù)字PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)

數(shù)子PCR技術(shù)與第一代PCP（定性PCR技術(shù)）、二代PCR技術(shù)（相對(duì)定量PCR技術(shù)）相比，具有很多優(yōu)勢(shì)：

1）特異性、靈敏性均有顯著提高；

2）在不依賴內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，直接得到絕對(duì)定量結(jié)果；

3）不需要大量復(fù)雜的相對(duì)定量計(jì)算，直接呈現(xiàn)靶分子原始濃度/拷貝數(shù)；

4）微反應(yīng)單元相互獨(dú)立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴(kuò)增產(chǎn)物間的相互干擾，極大的提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。

表1. 數(shù)子PCR與熒光定量PCR技術(shù)比較

	數(shù)字PCR（dPCR）	熒光定量PCR（qPCR）
檢測(cè)靈敏度	0.01%(高)	1%（低）
是否絕對(duì)定量	是	否
特異性	高	一般
數(shù)據(jù)重復(fù)性	高	一般
是否需要標(biāo)準(zhǔn)曲線	否	是
檢測(cè)方法	Taqman探針和染料法	Taqman探針和染料法
抗干擾能力	很強(qiáng)	弱
檢測(cè)價(jià)格	略高	低

4.  數(shù)字PCR技術(shù)路線——固相分割技術(shù) vs 油包水分割技術(shù)

數(shù)字PCR根據(jù)液滴分割方式的不同，數(shù)字PCR產(chǎn)品主要分為固相分割芯片和油包水式等。不論是哪種形式的數(shù)字PCR產(chǎn)品，整體上都由微反應(yīng)單元生成、擴(kuò)增信號(hào)檢測(cè)與分析兩個(gè)部分組成。

其中，微流控芯片式的體系兼容性更高，芯片工藝較為復(fù)雜；油包水系統(tǒng)簡(jiǎn)單，但是體系變化時(shí)易發(fā)生破裂和融合，導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。

表2. 數(shù)字PCR技術(shù)路線比較（微孔固相分割技術(shù) vs 油包水分割技術(shù)）

數(shù)字PCR技術(shù)路線	固相分割法	油包水分割法
液滴均一性	均一性高，cv<1%	均一性弱，cv>5%
有效液滴率	高，>95%	低，<80%
信號(hào)信噪比	高，陰陽(yáng)性信號(hào)區(qū)分能力高	低，陰陽(yáng)性信號(hào)區(qū)分能力弱
第三方試劑兼容性	兼容第三方試劑，快速開(kāi)發(fā)應(yīng)用試劑盒，使用成本低	不兼容，試劑封閉，應(yīng)用開(kāi)發(fā)慢，使用成本高

5. 數(shù)字PCR市場(chǎng)和應(yīng)用

目前，在我國(guó)市場(chǎng)中用于基因檢測(cè)的技術(shù)主要分為PCR技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)、FISH技術(shù)和基因芯片技術(shù)四種。其中PCR技術(shù)包括普通PCR、熒光定量PCR和數(shù)字PCR。測(cè)序包括一代測(cè)序、二代測(cè)序和三代測(cè)序等。

根據(jù)技術(shù)和市場(chǎng)發(fā)展進(jìn)度，數(shù)字PCR屬于快發(fā)展階段，在臨床檢測(cè)、科學(xué)研究、生物制藥和計(jì)量等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。

圖3 數(shù)字PCR發(fā)展階段

作為第三代的PCR技術(shù)，數(shù)字PCR具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

在腫瘤伴隨診斷方面：數(shù)字PCR通過(guò)檢測(cè)患者血液DNA/RNA，可以了解患者腫瘤發(fā)生發(fā)展，如通過(guò)血液檢測(cè)肺癌EGFR、BRAF、KARS等基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤伴隨診斷。

另外，數(shù)字PCR被譽(yù)為基因檢測(cè)領(lǐng)域，靈敏度最高（0.01%）的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于很難取得腫瘤組織的樣本，數(shù)字PCR可以通過(guò)檢測(cè)體液樣本（血液、唾液、尿液和痰液等）實(shí)現(xiàn)腫瘤檢測(cè)。

在遺傳生殖方面：數(shù)字PCR具有極佳的信噪比，在遺傳生殖方面發(fā)揮了巨大作用，如SAM，NIPT等檢測(cè)。目前NIPT主要用高通量測(cè)序技術(shù)，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高、需要專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，而且很難在院內(nèi)落地，尤其是二/三線城市醫(yī)院。數(shù)字PCR檢測(cè)只需要4小時(shí)左右，相比NGS可以降低2/3的成本，可以很快在二/三線城市醫(yī)院落地，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。

對(duì)于SMA的檢測(cè)：數(shù)字PCR可以同時(shí)檢測(cè)SMN1和SMN2，國(guó)內(nèi)SMA治療藥物已經(jīng)進(jìn)入醫(yī)保，SMN2的定量檢測(cè)可以指導(dǎo)用藥，而數(shù)字PCR可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)SMN2拷貝數(shù)定量，其作用也是不可替代的。

針對(duì)病原微生物和食源性致病菌檢測(cè)：數(shù)字PCR檢測(cè)時(shí)間是3小時(shí)左右，可實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的定量檢測(cè)需求。

小海龜超多重?cái)?shù)字PCR單個(gè)反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)15-20種病原體，滿足病原體超多重檢測(cè)的需求。

在計(jì)量研究領(lǐng)域：數(shù)字PCR是核酸標(biāo)準(zhǔn)品定量的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；

在核酸藥物質(zhì)控領(lǐng)域：數(shù)字PCR是rAAV、mRNA疫苗、Car-T等生物藥的最佳劑量質(zhì)控技術(shù)。

對(duì)于環(huán)境微生物：數(shù)字PCR具有極高的抑制物耐受性，可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)環(huán)境DNA定量監(jiān)控，適用于多種生態(tài)學(xué)研究。

圖4  數(shù)字PCR熱門研究方向